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研域生物帶你繞開ELISA試驗(yàn)中呈現(xiàn)的各種問題
發(fā)布時間： 2019-06-11 點(diǎn)擊次數(shù)： 1660次ELISA是蛋白定量的金規(guī)范，也是免疫學(xué)研討中常用的試驗(yàn)辦法之一。很多人覺得ELISA很簡單，其實(shí)不然。今天研域生物帶你繞開ELISA試驗(yàn)中呈現(xiàn)的各種問題，輕松搞定ELISA試驗(yàn)~
1.間接法
檢測抗體常用的辦法, 首要用于對病原體抗體的檢測。
優(yōu)勢：二抗能夠加強(qiáng)信號，并且有多種挑選能做不同的測定剖析。不加酶符號的一級抗體則能保存它多的免疫反應(yīng)性。
缺點(diǎn)：交互反應(yīng)發(fā)生的機(jī)率較高
2.雙抗體夾心法
檢測大分子抗原常用的辦法。
優(yōu)勢：高活絡(luò)、高專一性，抗原無須事前純化。
缺點(diǎn)：抗原必定得具有兩個以上的抗體結(jié)合部位。
3.競爭法
檢測小分子半抗原（藥物、激素等）。
優(yōu)勢：可適用比較不純的樣本，并且數(shù)據(jù)再現(xiàn)性很高。
缺點(diǎn)：整體的敏感性和專一性都較差。
常見問題剖析
Q1.標(biāo)曲不顯色或顯色很弱，樣本顯色溶解規(guī)范品以及倍比稀釋時，未渦旋震動或不行充沛。
規(guī)范品溶解、倍比稀釋時均需求渦旋震動以保證充沛混勻。單純依托移液器重復(fù)吹打，效率較低、作用也不必定jia。
Q2.標(biāo)曲和樣本均不顯色在孵育階段靜置在桌面上，這樣非常不利于抗原抗體之間的充沛接觸，導(dǎo)致顯色偏弱。
推薦孵育階段，運(yùn)用ELISA的微孔板振蕩器，調(diào)至適宜的頻率，使抗原抗體充沛接觸，保證結(jié)合作用。假如排除上述原因，有可能是漏加了某個組分，如檢測抗體、酶等。關(guān)于比較大意的新手，必定要做好符號和記錄，或者運(yùn)用增加染料的ELISA試劑盒。
Q3.標(biāo)曲顯色，樣本不顯色當(dāng)樣本中意圖蛋白濃度極低或者樣本中攪擾要素較強(qiáng)，就無法檢測到。現(xiàn)在ELISA仍然是蛋白檢測活絡(luò)度gao的辦法，與不同技能結(jié)合后，衍生出了多種類型的ELISA，提高了檢測活絡(luò)度。
關(guān)于意圖蛋白濃度特別低的樣本，能夠嘗試用高敏ELISA，但這也并不意味著必定能檢測到樣本濃度，只能說能夠提高樣本的可測率，并使成果愈加牢靠。因?yàn)橥ǔＳ靡话鉋LISA檢測的樣本OD值都偏低，而高敏ELISA可提高樣本OD值，使之盡量位于標(biāo)曲范圍內(nèi)，得到的數(shù)值也愈加可信。
Q4.標(biāo)曲和樣本都顯色，但復(fù)孔的CV大這個問題就跟移液器和試驗(yàn)者的操作有關(guān)了。移液器的運(yùn)用維護(hù)不規(guī)范，就會造成移液的誤差較大；試驗(yàn)者自身的操作習(xí)慣、加樣的一致性對復(fù)孔的CV也有很大影響。
掌握移液器的正確運(yùn)用和維護(hù)。關(guān)于個人的操作可操練移液動作、加快速度，保證移液的精密度。
Q5.本底偏高，樣本值測不到標(biāo)曲的本底即Blank孔的OD值一般要求控制在0.1以下(關(guān)于高敏ELISA能夠恰當(dāng)放寬要求)。尤其是樣本值特別低的時分，本底過高會掩蓋意圖信號，導(dǎo)致無法測到樣本值。
在參加TMB顯色后，需實(shí)時觀察標(biāo)曲顯se狀況。通常在S5孔有肉眼可見的微弱藍(lán)色，即可停止反應(yīng)。
Q6.樣本經(jīng)不同梯度稀釋，核算得到的樣本值差異較大有時分咱們不清楚樣本中意圖蛋白的濃度怎么，應(yīng)該怎么稀釋，那么咱們就會做下預(yù)試驗(yàn)，確認(rèn)稀釋倍數(shù)。但是有時分同一樣本做了幾個不同梯度稀釋后，核算得到的樣本值之間差異較大，應(yīng)該挑選哪一個稀釋倍數(shù)呢？
這里觸及到了基質(zhì)效應(yīng)。通常血清樣本加樣量較高時，血清中的各種蛋白會抑制抗原抗體的接觸，基質(zhì)效應(yīng)較顯著。而經(jīng)過稀釋后，攪擾要素也隨之稀釋，影響就會較小。當(dāng)某兩個梯度稀釋后，核算得到的樣本值挨近時，咱們就能夠以為在該稀釋梯度時，樣本中的攪擾要素影響較小，核算得到的值也是挨近真實(shí)的。但是這樣的稀釋是針對意圖蛋白濃度較高的樣本而言。關(guān)于濃度很低的樣本，經(jīng)過多倍稀釋后，就愈加測不到了，此刻可依照廠家說明書推薦的加樣方法操作。
Q7.不同試劑盒中的組分能否通用除非是共用的試劑如洗液、檢測緩沖液，其它組分不建議用其它試劑盒的組分，乃至是同一指標(biāo)不同批次的試劑盒里的組分。這些組分(包含規(guī)范品、規(guī)范品稀釋液、檢測抗體、酶等)都是經(jīng)過優(yōu)化的，假如輕率運(yùn)用其它試劑盒的組分，有可能對成果產(chǎn)生影響。